1 如果你用了插入片斷特異的引物擴(kuò)增 ， 那么可能是你連接時(shí)加的目的片斷過多 ， 菌表面粘附了目的片段（我曾經(jīng)在沒有斑的地方蘸一下 ， 也能P出目的帶） ， 因此很可能出現(xiàn)假陽性 。這樣驗(yàn)證陽性克隆時(shí)建議你1〉用插入片斷兩端的測(cè)序引物（如M13F+R） ， 做個(gè)PCR ， 看能否擴(kuò)出目的大小的帶 ， 如果有 ， 說明肯定有片斷連入T載體；如果能用一個(gè)測(cè)序引物和一個(gè)你自己的引物擴(kuò)增就更好了 ， 不但可以確定插入的方向還可以肯定是你的片斷插入 。2〉可以抽出質(zhì)粒后 ， 酶切驗(yàn)證（這個(gè)最保險(xiǎn)）；但是質(zhì)粒很少時(shí) ， 用你的特異引物 ， 進(jìn)行較少循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增 ， 如果能拿到很亮的帶 ， 那么很可能是陽性；因?yàn)樘豳|(zhì)粒后蘸附的片斷會(huì)很少 ， 而質(zhì)粒作模板有利于目的基因的克隆2 如果你的菌中質(zhì)粒拷貝數(shù)很低 ， 基因組比較復(fù)雜（如農(nóng)桿菌） ， 有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性（不能P出帶） ， 這時(shí) 。可以提質(zhì)粒后在PCR驗(yàn)證 。
【關(guān)于菌落pcr】
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